ロドプシンGタンパク質の解析

Scientific Reports volume 12、記事番号: 8243 (2022) この記事を引用

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住血吸虫症は、住血吸虫属の蠕虫寄生虫によって引き起こされる医学的に重要な病気です。住血吸虫の生活環には、中間宿主（水生カタツムリ）および最終宿主（ヒト）との化学媒介相互作用が必要です。カタツムリの段階で寄生虫の発生を阻止するには、カタツムリの宿主と住血吸虫の水系自由生活型（ミラシジウム）の間の相互作用について理解を深める必要があります。カタツムリのゲノミクスと水生化学コミュニケーションの革新は、カタツムリと寄生虫の共進化を分子レベルで探求する理想的な機会を提供します。ロドプシン G タンパク質共役受容体 (GPCR) は、吸虫寄生虫がカタツムリ宿主に向かってどのように移動するかを研究する上で特に興味深いものです。寄生虫における GPCR の潜在的な役割により、GPCR は宿主のライフサイクルの中間段階を破壊し、その後のヒトへの感染を防ぐ新しい抗蠕虫薬の標的候補となります。ゲノムバイオインフォマティクスアプローチを使用して、カタツムリ Biomphalararia glabrata とその偏性寄生虫であるマンソン住血吸虫のミラシディアの間の GPCR オーソログを同定しました。我々は、奇跡段階内で発現された8つのマンソン住血吸虫ロドプシンGPCRが、特に膜貫通ドメイン内で8つの異なるB. グラブラタロドプシンGPCRと全体的なアミノ酸類似性を共有していることを示し、構造的特徴が保存されていることを示唆している。これらの GPCR には、オーファンペプチド受容体のほか、ラブドメリックオプシン受容体、セロトニン受容体、スルファキニン (SK) 受容体、アラトスタチン A (ブカリン) 受容体、FMRFアミド受容体と強い配列相同性を持ついくつかの受容体が含まれます。ブッカリンおよびFMRFaペプチドは、B. glabrataによって調整された水中で同定され、合成ブカリンおよびFMRFaがマンソン住血吸虫ミラシディアにおける方向転換および方向転換反応の顕著な速度を刺激できることを示した。オーソログ GPCR は、S. mansoni miracidia および B. glabrata で同定されました。これらの GPCR は、奇跡的な宿主の発見を促進する可能性があるカタツムリ由来の臭気物質を含む、同様のリガンドを検出する可能性があります。これらの結果は、GPCRが宿主発見を媒介する機構を解明する将来の研究の基礎となり、新たな抗住血吸虫介入法の開発の可能性をもたらします。

住血吸虫属の後生動物蠕虫吸虫は、ヒト住血吸虫症の主な病原体であり、この病気は74か国で流行しており、世界中で2億人以上が罹患しています1。世界では、毎年最大 20 万人が住血吸虫症により直接的または間接的に死亡しており 2、推定 6 億人が流行地域に住んでいます 3。住血吸虫は複雑な雌雄異株の生活環を持ち、軟体動物の中間宿主で無性生殖する幼虫と哺乳類の最終宿主で有性生殖する成虫が関与します。水中では、マンソン住血吸虫の卵が自由生活性の移動性ミラシジウムに孵化し、このミラシジウムは適合するカタツムリの宿主であるビオンファラリア・グラブラタを探して感染する必要があります4。感染後、単一のミラシジウムは母と娘のスポロシストを介して無性生殖して数千のセルカリアとなり、それぞれが放出されると人間の宿主内で成虫に成長する可能性があります。住血吸虫のライフサイクルに関連する複雑な生理学的および形態学的変化は、人為的な感染制御がライフサイクルのいくつかの段階で行われる可能性があることを意味します。現在、成虫は通常、感染した人間をプラジカンテルという薬剤で治療することによって標的とされています5。それにもかかわらず、この病気は発展途上国において依然として脅威であり、世界保健機関はカタツムリの感染段階に関する継続的な研究が必要であることを認めています6。たとえば、住血吸虫の生活環を妨害する別の方法には、ミラシジウムまたはセルカリアの宿主探索行動を標的とする駆虫薬の適用が含まれる可能性があります7,8。

住血吸虫ミラシジウムは視覚が制限されており、適切な宿主カタツムリを見つけるのにかかる時間も限られています（12～16時間）。宿主の特定には、宿主の局在化を促進するさまざまな行動反応が含まれ、それによって感染が成功する可能性が高まります10、11。中間宿主と同じ生活環境を共有することにより、奇蹟段階は寄生虫の生活環を中断する理想的な地点となり、宿主の発見に必要な分子成分を評価するためのターゲットウィンドウとなる。 2 つの主要な行動反応が発生します。これは、光受容体媒介による影響を受ける最初の分散および指向性段階と、嗅覚媒介による二次探索および旋回段階 (ケモキネシス) から構成されます。現在までに、住血吸虫ミラシジアによる嗅覚媒介宿主検出を決定づける根本的な分子機構に関する情報はほとんど得られていないが、最近、ミラシジアの行動変化を誘導するペプチドが B. glabrata から発見された 15。

G タンパク質共役受容体 (GPCR) は、真後生動物の化学感覚受容体としてよく知られており 16、寄生虫の宿主発見を理解するための有望な研究対象となっています。 GPCR および下流の生化学経路は、寄生虫のライフサイクル中断のための選択的な薬理学的標的としてよく使用されるため 17,18 、したがって、奇跡的操作の効果的な標的となる可能性があります。分子レベルでは、ゲノムにコードされた一連の感覚型タンパク質の発見など、マンソン住血吸虫受容体の生物学およびシグナル伝達経路に関するいくつかの報告がある19,20。これらには、化学リガンドと相互作用する可能性のある GPCR21 が含まれます。この概念は、住血吸虫のミラシジウムおよび成体の外皮基質における GPCR を同定したプロテオミクスおよび機能発現解析によって裏付けられています 11、22、23。マンソン住血吸虫ゲノムの精査により、Phobius、HMMerSearch、および Pfam スキャンを含む 3 つのバイオインフォマティクスアルゴリズムの組み合わせを使用して、多数のロドプシン型 GPCR 配列が明らかになりました 24,25。ミラシジウムで発現されるものには 2 つのオプシン受容体が含まれており、これらがミラシジウムの光運動学的挙動を支えている可能性があります 26,27。

新しい情報は、カタツムリとその偏性住血吸虫寄生虫の密接な関係が、それぞれのゲノムの形成に役立っていることを示しています。ヒト宿主ではなくカタツムリ宿主の遺伝的多様性は、住血吸虫の生活史形質の変動に影響を与えるより重要な要因である可能性があります28、29、30。例えば、カタツムリとマンソン住血吸虫の異なる株との間に相同なムチンタンパク質が存在することが、カタツムリの宿主と寄生虫の適合性の根底にある重要な要素である可能性があることが注目されている 31。これは、非長末端反復レトロトランスポゾン乱反射配列の非コード 5' 領域と 3' 領域の有意な相同性の発見と一致しています。これらのクラス I 転移因子は、宿主と寄生虫の異なるゲノム位置にコピーアンドペーストするため、宿主配列が寄生虫に水平移動する可能性が示唆されています 32,33。

この研究では、B. glabrata のロドプシン様 GPCR と重要な配列同一性を共有するマンソン住血吸虫ミラシディアロドプシン様 GPCR を同定しました。この新しい知識は、マンソン住血吸虫ミラシディアに対するペプチド挙動バイオアッセイを導き、FMRFaおよびブカリンペプチドが宿主の所見と一致する挙動を誘発できることを実証した。

動物実験を伴う実施および手順は、QIMR Berghofer Medical Research Institute の動物倫理委員会によって承認されました (プロジェクト番号 P242)。この研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に従って実施されました。研究はARRIVEガイドラインに従って実施されました。

肝臓は、オーストラリア農水産林業省 (DAFF) が指定した条件下でマンソン住血吸虫 (プエルトリコ株) に感染した ARC Swiss マウスから採取しました。マウスを CO2 ガスで安楽死させ、肝臓を冷却した PBS で灌流しました。マンソン住血吸虫の卵は、マウスの灌流中に収集されました。 4 つの感染マウス肝臓をメスの刃でスライスし、50 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で滑らかな粘稠度になるまで混合しました。比較的きれいな住血吸虫の卵とミラシジウムを得るために、2 日間のプロトコルが使用されました 34。簡単に説明すると、卵とマウス肝臓組織の混合物をコラゲナーゼ B、ペニシリンおよびストレプトマイシンとともに 37 °C で一晩インキュベートし、続いて Percoll カラム (50 ml チューブ中の 8 ml Percoll + 32 ml の 0.25 M スクロース) を使用して分画しました。卵ペレットを、第２のＰｅｒｃｏｌｌカラム（１５ｍｌチューブ中の２．５ｍｌのＰｅｒｃｏｌｌ＋７．５ｍｌの０．２５Ｍスクロース）上でＰＢＳを使用して２回洗浄した。精製卵を、口唇から４ｃｍの上部を除いて遮光黒色テープで完全に巻いた２００ｍｌの孵化メスシリンダーに移し、それによって光勾配を生じさせた。孵化シリンダーの上部に pH 中性の MilliQ 水をテープで覆われた領域から約 1.5 cm 上まで注ぎ、27 °C の明るい光に曝露しました。卵は孵化後 6 時間培養され、ミラシジウムを含む水の上部 10 ml がミラシジウム単離のために収集されました。孵化したミラシジウムを、8,000 × g、4 °C で 1 分間の遠心分離によって単離し、水で 2 回洗浄しました。 RNA を分離するために、ミラシジウムを孵化後 6 時間で収集し、-80℃ で保存しました。メーカーのユーザーガイド (Invitrogen、USA) に従って TRIzol 試薬を使用してマンソン住血吸虫ミラシディア (3 回孵化後 6 時間) から全 RNA を単離し、RNA の量と品質を UV 分光光度法 (NanoDrop ND-1000) によって評価しました。 RNA は、次世代 Illumina 2500 プラットフォーム RNA-seq のために NovoGene (香港) に送られました。生の配列データは、アクセッション番号 SRR17224866 で GenBank NCBI に寄託されました。マンソン住血吸虫ミラシディア生配列データのデノボトランスクリプトームアセンブリは、前述のように Trinity を使用して実行され 35,36、コンティグは Transdecoder35 を使用してタンパク質配列に翻訳されました。マンソン住血吸虫ミラシダの遺伝子発現レベルは、CLC Genomic Workbench を使用して、WormBase Parasite (https://parasite.wormbase.org/Schistosoma_mansoni_prjea36577/Info/Index/) に由来するマンソン住血吸虫参照ゲノムに対して生の配列データをマッピングすることによって計算されました。デフォルトパラメータ37。

B. glabrata と S. mansoni の間で共有されるオルソログ GPCR を同定するためのパイプラインを図 1 に示します。 B. glabrata については、GPCR とさまざまな組織におけるその発現レベルに関するデータが以前の研究から取得されました 6。マンソン住血吸虫では、ロドプシン GPCR ファミリーに属する受容体を同定するために、トランスクリプトーム由来のタンパク質配列で Pfam ベースのプロファイルと TM ドメインが検索されました。具体的には、これには、TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) と Phobius (http://phobius.sbc.su) を含む、すべてのタンパク質の TM ドメインを予測する 2 つのバイオインフォマティクスツールが含まれていました。せ/)。 TM ドメインは GPCR にとって便利なマーカーであるため、7-TM ドメインを含む配列のみに焦点を当てました。次に、HMMerSearch (http://www.hmmer.wustl.edu/) を使用して、Pfam ベースのプロファイル検索を適用しました。推定上のロドプシン型 GPCR ドメインを含むタンパク質は、HMMer パッケージ (http://www.hmmer.wustl.edu/) および PFAM モデル PF00001 (7tm_1) を使用したプロファイル隠れマルコフモデル検索によって系統的に同定されました。

B. glabrata ゲノムと S. mansoni miracidia のトランスクリプトームからマイニングされた共有 GPCR を同定するためのワークフロー。

マンソン住血吸虫ミラシディアで同定された推定 GPCR を使用して、B. グラブラタ GPCR データベースを検索しました (tBLASTp を使用)。 E 値 < 1.0E-20 の配列を取得し、TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) を使用して反復膜貫通モチーフの存在についてスクリーニングしました。 7 つの膜貫通 (TM) ドメインを含むものが、さらなる分析のために選択されました。複数の配列アラインメントは、MUSCLE39 アルゴリズムを備えた分子進化遺伝学解析 (MEGA) ソフトウェアバージョン 6.038 を使用して作成されました。系統樹は、ノードサポートのために 1000 回のブートストラップ複製を使用した近隣結合法を使用して構築されました。遺伝子オントロジーマッピングと機能アノテーションは、OmicsBox (BioBam)40 を使用して適用されました。最終的な系統樹とヒートマップは iTOL v541 で変更されました。

合成 FMRFa (FMRF-NH2)、ブッカリン (RLDRFGFAGQL-NH2)、および SK (NYGDYGIGGGRFGR) は、China Peptides (中国、上海) によって提供されました (純度 ≥ 95%)。セロトニン (5-ヒドロキシトリプタミン/5-HT) は Sigma (米国バーリントン) から提供されました (純度 ≥ 98%)。 FMRFa (100 μM)、ブカリン (100 μM)、SK (100 μM) および 5-HT (5 nM) のストック溶液を、MilliQ 水に溶解することによって調製しました。 MilliQ 水はバイオアッセイのネガティブコントロールとして使用されました。

Wang et al.21 に記載されているように、孵化後約 2 時間でのマンソン住血吸虫ミラシディアの分離を実施しました。各アッセイでは、pH 中性 MilliQ 水中で活発に遊泳する 30 ± 5 個のミラシジウム (合計約 4 ml) を、4 ml の MilliQ 水が入っているペトリ皿 (100 mm × 15 mm) の中央領域にピペットで均等に分配しました。顕微鏡下で分析する前に、光の偏りを防ぐために、ミラシジウムの遊泳エリアを覆いました。アッセイのために、2μlの試験溶液をペトリ皿の中央領域に添加した。 1 分間のテスト期間中に各分子のある程度の拡散が予想されました。アッセイは 10 倍および 100 倍の段階希釈でもテストされました。試験溶液の添加前後のミラシジウムの動きを記録するために、OLMPUS DPI デジタル顕微鏡カメラ DP22 (毎秒 15 フレームの速度で 2.8 メガピクセルの画像) を備えたビデオ機能付き倒立複合顕微鏡 (OLYMPUS CKX41) を使用しました。使用済み。実際のカメラの視野 (FOV) は 2.500 × 1.875 mm でした。ミラシディアの動きを各試験溶液の添加前後に 1 分間記録し、キャプチャしたビデオを Tracker 4.87 を使用して処理しました。

ミラシディアの軌道は、FOV への入口から出口まで手動で追跡され、FOV 内に残った軌道については最大 1 分間追跡されました。溶液添加の前後で、FOV の短辺の長さ (7.5 cm) を超えて泳いでいたミラシディアのみが含まれていました (ファイル S1)。そうでないものは統計的に無意味であると考えられました。ミラシディアが FOV 内に留まる平均持続時間は、もう 1 つの重要な行動特徴として考慮され、統計的に比較されました。溶液添加後１分以上滞留したミラシジアについては、その１分以内の時間を比較対象とし、平均加速度値を算出した。ミラシジウムの加速度および速度は、軌道に基づいて計算され、単位は cm s-2 および cm/s に変換されました。対応のある両側 t 検定を使用して P 値を計算しました。さらに、該当する場合は常に、二元配置分散分析 42 を実行して、試験溶液と陰性対照間の変化 (加速度、速度、時間) の重要性を評価しました。

候補ペプチドリガンドが B. glabrata 調整水中に存在するかどうかを確認するために、2 つのアプローチがとられました。まず、B. glabrata 調整水 43 の事前分析から得られた質量分析データを、標的前駆体タンパク質を使用して検索しました。

次に、B. glabrata で調整した水抽出物を使用して、抗体媒介ドットブロット分析を実行しました。 B. glabrata を pH 中性の MilliQ 水で洗浄し、20 ml の水を含むビーカーに室温 (RT) で 2 時間入れました。カタツムリを取り出し、（異なる水槽の）20 匹のカタツムリから調整水を収集し、20 ml のメタノールを各ビーカーに加えて完全に混合しました。調整水を PVDF Millex-HV シリンジフィルターユニット (0.45 μm) でろ過して、粒子と微生物を除去しました。濾液を急速冷凍し、凍結乾燥した。陰性対照として、これまでカタツムリに曝露されていない水を同様に処理した。ドットボットアッセイに必要な場合、サンプルを 200 μl MilliQ 水で再水和し、12,000 rpm で 5 分間遠心分離しました。上清を収集し、MilliQ 水で 1:1 に希釈しました。定量は、NanoDrop 2000c UV-Vis 分光光度計 (Thermo Scientific、ウォルサム、米国) を使用して A280nm で実行されました。 B. glabrata 抽出物 5 g\(\upmu\)/\(\upmu\)l、500 ng/\(\upmu\)l、および 50 ng/\(\upmu\)l を上に適用しました (2 μl)。 1 × リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) にあらかじめ浸漬し、室温で 10 分間空気乾燥させたニトロセルロース膜 (0.45 m\(\upmu\)、BioRad、Hercules、US)。メンブレンをブロッキング緩衝液（PBS中2%（v/v）スキムミルク）中で1時間インキュベートし、一次抗体を添加しました[1:500; ウサギ抗ブカリン 44、ウサギ抗 FMRFa (Genscript、米国ピスカタウェイ)、ラット抗 5-HT (Sigma)] を室温で 1 時間。膜をPBS-Tween20 (0.1% (v/v))で洗浄し、二次抗体[1:5000; 1:5000; 抗ウサギ Ig-IR 680 (LI-COR、リンカーン、米国) または抗ラット Ig-IR 795 (LI-COR)]。 PBSTでの洗浄(3回、5分)後、Odyssey CLx、LI-COR装置を使用してブロットを視覚化しました。

マンソン住血吸虫ミラシディアルトランスクリプトーム生配列データは、アクセッション番号 SRR17224866 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRR17224866) で GenBank NCBI に寄託されました。マンソン住血吸虫の参照ゲノムは、WormBase Parasite (https://parasite.wormbase.org/Schistosoma_mansoni_prjea36577/Info/Index/) から入手できます。オリジナルの B. glabrata タンパク質データセットは、VectorBase (https://vectorbase.org/vectorbase/app/downloads/Current_Release/BglabrataBB02/fasta/data/) から入手できます。

TMHMM 予測に基づいて、マンソン住血吸虫トランスクリプトーム由来のタンパク質モデルから、7-TM ドメインを持つ合計 96 個のタンパク質が抽出されました。 Phobius の予測により、7-TM ドメインを持つ 139 個のタンパク質が同定されました。両方の予測の Pfam プロファイリングにより、87 個のタンパク質 (E 値 < 0.0004) がロドプシン型受容体として分類されました。すべての B. グラブラタロドプシン GPCR に対するこれらの GPCR の BLASTp 分析では、8 つの GPCR (表 1) について、26 ～ 48% のアミノ酸同一性で有意な一致 (E 値 < 1.0E-20) が示されました (ファイル S2a)。 NCBI 非冗長 (nr) データベースに対してすべてのマンソン住血吸虫および B. グラブラタオーソログ GPCR を使用した BLASTp 検索により、5-HT (セロトニン)、アラトスタチン A 型 (AST-A)、FMRFa、 SK、オレキシンタイプ 2、神経ペプチド F、オーファンペプチド、およびオプシン様 GPCR (表 1、図 2A およびファイル S2b)。 B. glabrata では、すべての GPCR が CNS で発現していましたが、オーファンロドプシン GPCR が最も広い組織分布を持っていました (図 2B)。マンソン住血吸虫ミラシディアでは、ロドポプシン GPCR オーソログが他の受容体と比較して最も高い平均発現レベルを示すことが判明しました (図 2B)。

B. glabrata と S. mansoni ミラシディア間で共有される GPCR オルソログの特性評価。 (A) 共有 GPCR の系統樹解析。各 B. glabrata GPCR はマンソン住血吸虫由来のオルソログ受容体とクラスター化します。ブートストラップ値はクレードの信頼レベルをサポートします。 (B) 孵化後 6 時間のマンソン住血吸虫ミラシディアおよび異なる B. グラブラタ組織における共有 GPCR-(TPM 内) コード遺伝子の発現を示すヒートマップ。列は、マンソン住血吸虫ミラシディアの生物学的複製 (1 ～ 3) とその平均、およびビオンファラリア (グラブラタ) 組織を表します。

推定リガンドを有する種間 GPCR オーソログの解明は、カタツムリ由来の生体分子がマンソン住血吸虫ミラシディアにどのような影響を与えるかを調査する機会を提供しました。 5-HT は十分に確立された真後生動物の神経伝達物質であり、一方、B. グラブラタ神経ペプチド FMRFa、ブッカリン [軟体動物では AST-A ホモログとして認識される 45]、および SK は以前に B. グラブラタで同定されているため 6,46、その生物活性について試験されました。ミラシディア。 FMRFa およびブカリンペプチド (100 μM で 2 μl) の添加前後のミラシディアル運動の軌跡を図 3A、B に比較します。代表的な映画はムービーS1、S2でご覧いただけます。添加前、ミラシディアは通常、直接直線的な経路で FOV を横切って泳ぎました (図 3A、B - 前)。適用後、ミラシディアは FOV 内で局所的な動きを示し、円運動の増加も示しました (図 3A、B - 後)。ブッカリンまたはFMRFaペプチドを適用すると、10μMのブカリンを除き、FOV内のミラシジアはより長く泳ぎました（P値=0.2964）（図3C）。ブッカリンまたは FMRFa (100 μM および 10 μM) の添加後、加速度の変化は顕著でした (図 3D)。ペプチドは、ペプチドの位置の周囲に集中した水泳パターンを刺激しました。

ブッカリンおよびFMRFaペプチドを使用した奇跡的挙動アッセイ。 (A) 記録領域の中心にブッカリン溶液 (100 μM) を添加する前後のミラシディアル運動の代表的な軌跡。各色は、区別できない 1 つのミラシジウム個体を表します。代表的なアッセイビデオについては、ムービー S1 を参照してください。 (B) 領域の中心に FMRFa 溶液 (100 μM) を添加する前後のミラシディアの動きの代表的な軌跡。各色は、区別できない 1 つのミラシジウム個体を表します。代表的なアッセイビデオについては、ムービー S2 を参照してください。 (C) ブッカリンおよび FMRFa の添加前後の、ビデオ撮影ゾーンに残っているミラシディアの持続時間のグラフ、および (D) 平均加速値。

対照的に、5-HT (5 nM; 映画 S3) の適用後、FOV 内の時間はわずかでしたが、加速度の変化は顕著でした (ファイル S3)。ペプチド (100 μM) では、ペプチドが添加された領域にミラシジアがより長く滞在しますが、二元配置分散分析 (ファイル S4) で示されるように、平均速度に大きな変化はありませんでした。また、3 つの異なる濃度 (100 μM、10 μM、1 μM; 映画 S4) で SK ペプチドを添加しても、FOV 内の時間や平均速度に大きな変化はありませんでした。陰性対照として、MilliQ 水を S. mansomi miracidia でテストしましたが、行動の変化は観察されませんでした。

B. glabrata ブカリン前駆体には、多数のブカリン様ペプチドが含まれています (図 4A)。ブッカリンで最も保存されている領域は C 末端の FXGGIG で、翻訳後プロセシングを経てアミド化ペプチドになります。 B. glabrataからの調整水抽出物に対して行われたドットブロットは、10μgから0.1μgの抽出物希釈でブカリン様ペプチドの存在を示した(図4B)。 B. glabrata FMRFa 前駆体には、FMRFa、FLRFa、FIRFa などの多数の FMRFa 関連ペプチド (FaRP) が含まれています (図 4C)。ナイーブ B. glabrata カタツムリ調整水 43 に由来するプロテオミクス質量分析データの分析により、特定の FaRP 内ではないものの、FMRFa 前駆体に一致する 4 つのペプチドが同定されました。 B. glabrataからの調整水抽出物に対して行われたドットブロットは、10μg〜0.1μgの抽出物希釈でFaRPと類似したペプチドの存在を示した(図4D)。

Biomphalaria glabrata 前駆体配列と、B. glabrata 調整水中のブカリンおよび FMRFa のドットブロットアッセイ。 (A) ブッカリン神経ペプチド前駆体配列 (B) 10、1、および 0.1 mg の B. glabrata で処理した水抽出物に対する抗ブカリンを使用したドットブロット。 (C) ブッカリン神経ペプチド前駆体配列。 (D) 10、1、および 0.1 g\(\upmu\) の B. glabrata で調整した水抽出物に対する抗 FMRFa を使用したドットブロット。 -ve コントロールは精製水抽出物のみを表します。前駆体配列の場合、黄色 - シグナルペプチド、赤色 - 推定切断部位、緑色 - アミド化、灰色 - 生物活性ペプチド、ピンク - MS ペプチドが一致します。

マンソン住血吸虫ミラシディアはカタツムリ由来の生体分子に反応します43が、活性生体分子の正確な正体は明確に定義されていません。ある研究では、カタツムリの粘液内に存在する「ミラシジウム誘引糖タンパク質」が関与していると示唆されており 12、一方、B. glabrata カタツムリの調整水タンパク質からの in silico 解析では、特徴づけられていないマンソン住血吸虫タンパク質と B. glabrata タンパク質の相互作用が予測されています 43。ペプチドも関係しており、カタツムリ由来の新規ペプチド (P12 と名付けられました) がマンソン住血吸虫ミラシディアの行動の変化を刺激したと考えられています 47。

この研究では、寄生虫と宿主の相互作用に潜在的に関与する生体分子を絞り込むために、B. glabrata と S. mansoni の両方の遺伝子リソースを利用して、各生物が類似のリガンドを検出するために使用すると考えられるオルソログ GPCR を特定しました。我々は、8 つのマンソン住血吸虫ミラシディア GPCR が、GO マッピングだけでなく、推定上の TM ドメインに対応する領域内でも、8 つの B. グラブラタ GPCR と重要な同一性を共有していることを報告しました。これらには、FMRFa、AST-A/ブカリン、スルファキニンペプチドに結合する神経ペプチド GPCR と類似した GPCR が含まれます。我々は、ミラシディアルオルソログGPCRが、共通のリガンドを必要とする神経シグナル伝達に使用できる、および/または水中に存在する情報化学生体分子の検出に使用できることを提案します。後者の予想は、カタツムリのFMRFアミドおよびAST-A/ブカリンペプチドの存在下での奇跡的な行動の変化によって検証されました。

AST-A とその受容体は、さまざまな昆虫で特徴づけられており 48、幼若ホルモン生合成の阻害や摂食量の減少などの複数の機能に関与しており 48、AST-A 様神経ペプチドは腹足類やロッティアを含む二枚貝軟体動物で同定されています。 gigantea、Theba pisana、Aplysia californica、Crassostrea gigas49,50,51,52。ブッカリンは、A. californica の付属歯小閉鎖筋での最初の同定に続いて命名され 53、筋肉収縮の阻害、摂食および産卵の制御など、軟体動物のさまざまな活動に関与していると考えられています53,54,55。また、腹足類や二枚貝においても、B. glabrata のゲノムデータセットを含む公的に利用可能なゲノムデータセットの in silico 解析を通じて、AST-A/ブカリン受容体が同定されました 56。我々の研究では、マンソン住血吸虫がブカリン様ペプチドを有するという報告はないが、マンソン住血吸虫におけるAST-A/ブカリン受容体オルソログを同定した。実際、10 種の扁形蠕虫の包括的な神経ペプチド調査により、自由生活性ツリガネムシ Macrostomum lignano だけがブカリン様ペプチド (npp-9 遺伝子; GAYSGFLG) を持っていることが示されました 57。我々は、B. glabrata 調整水中のブカリン様ペプチドを同定しました。粘液分泌物中の神経ペプチドの存在は十分に研究されていないにもかかわらず、我々は以前に陸産貝類 T. pisana の唾液腺粘液内に神経ペプチド (ブカリンを含む) を同定しました 58,59。

FMRFa は、ハリ貝 Mercenaria mercenaria で最初に発見され、軟体動物の生理学において多面発現的な役割を果たしていると考えられています 60,61,62,63。淡水巻貝ヘリソマについて行われた広範な研究により、FMRFa および関連ペプチドが神経系だけでなく唾液腺内にも高密度で濃縮されていることが示されました 64。 FMRFa 受容体は、陸産貝類 Helix62,65 の心臓および神経組織、およびイカ Loligo pelei66 の視葉膜で同定されています。マンソン住血吸虫のゲノムには、2 つの RFアミドペプチド (HFMPQRFa および YTRFVPQRFa) を放出するためにプロセシングされる可能性がある FLP 前駆体 (npp-13 遺伝子) をコードする遺伝子が含まれています 57。非住血吸虫性板状蠕虫前駆体に由来する合成 FLP (GNFFRFa) は、in vitro でマンソン住血吸虫筋線維の収縮を刺激します 67。 FLP 受容体は、配列類似性と受容体カルシウム動員アッセイに基づいて、ツルベリア扁形動物 Girardia tigrina でも報告されています 68。マンソン住血吸虫ミラシディアのホモログ受容体は、B. グラブラタ FMRFa 受容体との類似性のため、今回の研究で調査されました。我々の行動アッセイでは、カタツムリ由来の FMRFa が、FOV 内で著しく長く滞在することと、B. glabrata 調整水中に FMRFa 前駆体ペプチドが存在することが観察されたことによって裏付けられた、ミラシディアの加速の増加により、マンソン住血吸虫ミラシディアによって検出できることも示されました。しかし、マンソン住血吸虫は内因性 FLP を生成する可能性があるため、適用された FMRFa が内因性効果を刺激し、観察された奇跡的な行動の変化につながる可能性を排除することはできません。

モノアミン 5-HT は神経伝達において重要な役割を果たしており、5-HT GPCR の保存と同様に、真後生動物全体で非常によく文書化されています。成体のマンソン住血吸虫では、5-HT が運動活動を刺激します 69 が、ミラシジウムでは、免疫蛍光アプローチにより 5-HT が感覚神経内に局在化しました 70。 5-HT GPCR は、我々の種間 GPCR オルソログ解析で同定されましたが、5 mM の 5-HT はミラシディアル挙動を変化させず、加速度の顕著な変化はその高濃度に起因する可能性があることがわかりました。

スルファキニンは、満腹（食物摂取）因子としての機能で最もよく知られている硫酸化神経ペプチドです71。インシリコデータマイニングにより、軟体動物のSKは昆虫のスルファキニンに共通するC末端RF(W)アミド配列と、昆虫のSKと脊椎動物のコレシストキニン(CCK)の両方に共有されるDYモチーフを持っていることが示された72。脊椎動物の CCK と昆虫の SK は、消化酵素の分泌、満腹感、平滑筋の収縮に関連する同様の生物学的機能を明らかにしているため、軟体動物の対応物も同様の基本的な生物学的活性を保持している可能性があります。対照的に、マンソン住血吸虫には明白なSKは存在せず、この寄生虫は、分泌された情報化学物質として、またはそれが増殖する肝膵臓に移動するための誘導ペプチドとしてカタツムリに侵入すると、B. グラブラタSKを認識するだけである可能性があることを示唆しています74 。我々の行動アッセイでは、SKは奇跡的な行動を変えず（FOV下で存在する速度も持続時間も影響を受けなかった）、したがってマンソン住血吸虫において内部刺激として作用する可能性が高いことを実証した。

FMRFa ペプチドとブカリンペプチドは、効果的な種特異的な誘引物質として使用できる生体分子のカクテルに寄与する可能性があります。我々の連続希釈アッセイでは、少なくとも 1 μM の濃度でブカリンペプチドと FMRFa ペプチドの両方の生物活性が持続することが示唆されました。また、B. glabrata および S. mansoni miracida 内の 1 つのオーファンペプチド GPCR オーソログも報告しています。これは、B. glabrata の多くの組織にミラシジウムが存在するため、未特徴の種特異的ペプチドがミラシジウムを適切なカタツムリ宿主に誘引するのに役立つ可能性と一致しています。マンソン住血吸虫ミラシディアにおけるその高い発現レベル。

伝播を最小限に抑え、住血吸虫症の蔓延を減らすには、カタツムリとミラシジウムの相互作用を妨害することが有望な生物防除計画です。私たちは、化学感覚伝達に一般的に使用される重要な生体分子である、B. glabrata と S. mansoni ミラシディア間で共有されるオルソログ GPCR を特徴付けました。 B. グラブラタブッカリンおよびFMRFa GPCRはバイオアッセイの良好な標的であり、その結果は、ブカリン様ペプチドの相同体がマンソン住血吸虫には存在しないという事実にもかかわらず、ブカリンおよびFMRFaが奇跡的行動の変化を刺激することを示した。これらの GPCR は、湖に適用され、カタツムリ宿主の住血吸虫検出を特異的に妨害する抗蠕虫化合物の開発のための新しい標的を提示する可能性があります。より高い種特異性を得るには、オルソログオーファンペプチド GPCR を脱オーファン化することが最も有利であると考えられます。これらの発見は、特に水生環境内での寄生虫とその宿主の間の化学感覚相互作用の理解をさらに助けます。

Gタンパク質共役型受容体

隠れマルコフモデル

分子進化遺伝学解析

リン酸緩衝生理食塩水

0.1% Tween 20 を含む PBS

4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール

パラホルムアルデヒド

視野

5-ヒドロキシトリプタミン

スルファキン

中枢神経系

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この研究を支援するために内部助成金を提供してくださったサンシャインコースト大学 (USC) に感謝します。私たちは、USC の Catherine Mainwaring 氏のご協力に感謝します。この研究は、オーストラリア政府の支援を受けている国家計算インフラ (NCI) のリソースの支援を受けて実施されました。 DPM は、QIMR Berghofer の National Health and Medical Research Council リーダーシップフェローおよび上級科学者です。 B. glabrata カタツムリは、BEI Resources を通じて配布するために、NIH-NIAID 契約 HHSN272201000005I を通じて生物医学研究所 (メリーランド州ロックビル) の NIAID 住血吸虫症リソースセンターから提供されました。我々は、この研究で得られた遺伝子配列に貴重なリソースを提供したビオンファラリアゲノムコンソーシアムに感謝します。

この研究は、オーストラリア研究評議会 (ARC、DP180103694_ から SFC、TW、DM) によって支援されました。資金提供者は、研究の設計、データの収集と分析、出版の決定、原稿の準備には何の役割もありませんでした。

バイオイノベーションセンター、サンシャインコースト大学、マルーチドール、QLD、4558、オーストラリア

フォン・ファン、ディ・リャン、ミン・ジャオ、コナー・フォガティ、ティアンファン・ワン、スコット・F・カミンズ

サンシャインコースト大学科学技術工学部、マルーチドール、QLD、4558、オーストラリア

フォン・ファン、ディ・リャン、ミン・ジャオ、コナー・フォガティ、ティアンファン・ワン、スコット・F・カミンズ

聖フランシスコ・ザビエル大学生物学部、アンティゴニッシュ、ニューサウスウェールズ州、B2G2W5、カナダ

ラッセル・C・ワイエス

分子寄生虫学研究所、QIMR Berghofer Medical Research Institute、ブリスベン、クイーンズランド州、4006、オーストラリア

メアリー・G・デューク & ドナルド・P・マクマナス

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研究の発案、設計、プロジェクトの監督：SFC、TW 調査とデータ解析の受託：PP、DL、CF、MZ、MD 各種ツールを使用した解析に貢献：DL、MZ、TW 論文執筆：PP、DL 、RW、DPM、および SFC すべての著者が原稿の最終版を読み、承認しました。

Phong Phan または Scott F. Cummins との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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Phan、P.、Liang、D.、Zhao、M. 他。ロドプシン G タンパク質共役受容体オルソログの分析により、寄生虫 (マンソン住血吸虫) と宿主 (ビオンファラリアグラブラタ) の情報化学ペプチドの相互作用が明らかになりました。 Sci Rep 12、8243 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-11996-x

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受信日: 2022 年 1 月 13 日

受理日: 2022 年 4 月 25 日

公開日: 2022 年 5 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11996-x

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